miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒(加尾法)
miRNA Real-Time PCR Assay kit 采用 SYBR Green I 嵌合染料法的原理進行 miRNA 熒光定量檢測。預混液中含有通用型ROX，適用于所有qPCR儀，使用qPCR Mix時不需要額外添加ROX來校正儀器。miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒(加尾法)
miRNA Real-Time PCR Assay kit
miRNA 熒光定量 PCR 檢測試劑盒
miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒(加尾法)
目錄號：71419
產品內容
Components | 71419-125 125 rxns (20 μl/rxn) | 71419-500 500 rxns (20 μl/rxn) |
2x Universal miRNA SYBR Green qPCRMix | 1.25 ml | 1.25 ml x4 |
Reverse primer(10μM ) | 55 μl | 55μl x4 |
RNase-FPCR反應液ree H2O | 1 ml | 5 m |
保存條件
-20℃保存，有效期 24 個月。
qPCR Mix 使用前，充分融解，輕柔顛倒混勻，短期使用可放在 4 ℃，避免反復凍融。
Reverse primer(10μM )每次用完置-20 ℃保存。
產品簡介
miRNA Real-Time PCR Assay kit 采用 SYBR Green I 嵌合染料法的原理進行 miRNA 熒光定量檢測。
其中2x Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix是專門為miRNA 定量檢測而研發的新一代2x預混液，包含除引物和 DNA 樣品以外的所有 qPCR 組分，可減少操作步驟，縮短加樣時間，降低污染幾率。其核心組分是全新的 Hotmaster Taq DNA 聚合酶，配合精心優化的 Buffer 體系，有效抑制非特異性擴增，可對寬廣濃度范圍的模板進行準確定量，獲得穩定可靠的 qPCR 結果，具有靈敏度高、特異性強、穩定性好等特點。
預混液中含有通用型ROX，適用于所有qPCR儀，使用qPCR Mix時不需要額外添加ROX來校正儀器。
注意：該試劑盒需要與增強型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（加尾法）配套使用。
1. 需要自備的試劑：待檢測miRNA對應的qPCR上游引物（Forward primer）
2. 待檢測miRNA對應的qPCR上游引物（Forward primer）
Forward Primer設計原則：
1. 遵循引物設計的zui普遍原則。
2. 以成熟的miRNA 序列為基礎，將U 替換成T，這是最基礎和zui簡單的設計方法。
3. 試劑盒中提供的下游引物的Tm 值為65℃，設計上游引物的Tm 值要盡量保證在65℃左右。
4. 若按照原則2 的方式直接設計的引物其Tm 值過低，可以在引物的5’端添加幾個堿基（最好為G 或C 堿基）；也可以在3’端添加1 個或幾個A 堿基；或者5’端和3’端同時修飾。
5. 若按照原則2 的方式直接設計的引物其Tm 值過高，可以在引物的5’或3’端去掉幾個堿基。
操作步驟：
1. 將DNA模板、引物、2x Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix、RNase-Free H2O溶解并置冰上備用。
2. 使用時請將2 x miRNA qPCR Mix上下顛倒輕輕均勻混合，避免起泡，并經輕微離心后使用。
3. 冰上配制qPCR反應體系：（以20μl反應體系為例）
Components | Volume (20μl) | Final Concentration |
2 x Universal SYBR Green qPCR Mix | 10 μl | 1× |
miRNA第一鏈cDNA | Variable | As required |
Forward Primer (10μM) | 0.4 μl | 0.2 μM each |
Reverse Primer (10μM) | 0.4 μl | 0.2 μM each |
RNase free H2O | Up to 20 μl | Not applicable |
1） 推薦模板加樣量為1-2μl / 20μl反應體系，miRNA 第一鏈cDNA不應超過總反應體系的10%，對于特殊的檢測體系中，高含量的cDNA 模板易導致非特異性擴增，根據所檢測miRNA 的豐度適當的稀釋cDNA（10倍或者100倍）。
2） 本品中含有熒光染料Sybr Green I，保存本品或配制PCR反應液時應避免強光照射。
3） 通常推薦引物濃度為0.2 μM，就可以得到較好的結果，反應效果不佳時可在0.1 - 1.0 μM范圍內進行調整。擴增效率不高的情況下，可提高引物濃度；發生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優化反應體系。
4. qPCR反應程序
注意：
1） 絕大多數情況下，使用二步法或三步法均可獲得良好效果。二步法擴增特異性高，三步法擴增效率高。如果融鏈曲線較差，可以嘗試兩步法擴增或提高退火溫度；如果因使用Tm值較低的引物等原因，得不到良好的實驗結果時，可嘗試加長延伸時間或者進行三步法PCR擴增。
2） 根據引物的Tm值進行退火&延伸（退火）溫度的設定；
3） 延伸（退火&延伸）時間的設置還需要根據您所使用的qPCR儀所需要的最短數據采集時間自行調整。
4） 融解曲線分析請以所使用的熒光定量PCR儀推薦的程序進行設定。
miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒(加尾法)
