miRNA反轉錄/熒光定量檢測試劑盒
本產品包含25 rxns (20 μl/rxn) 的miRNA逆轉錄（加尾法）和500 rxns (20 μl/rxn)的2x miRNA qPCR Mix。miRNA反轉錄/熒光定量檢測試劑盒
miRNA RT-qPCR Detection kit
miRNA 反轉錄/熒光定量檢測試劑盒（All In One）
miRNA反轉錄/熒光定量檢測試劑盒
目錄號:71613
產品內容
Components | 71613-500 RT 25 rxns /qPCR 500 rxns(20μl/rxn) |
miRNA RT Enzyme Mix | 50 μl |
2x miRT Reaction Mix | 250 μl |
2x Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix | 1.25 ml x4 |
Reverse primer(10μM ) | 200 μl |
RNase-Free H2O | 5 ml |
保存條件
-20℃保存，有效期 12 個月。
產品簡介
本產品包含25 rxns (20 μl/rxn) 的miRNA逆轉錄（加尾法）和500 rxns (20 μl/rxn)的2x miRNA qPCR Mix。
本產品采用 Poly（A）加尾法，以miRNA為模板，采用特殊優化預混合 miRNA RT Enzyme mix（包含Poly(A)加尾酶和反轉錄酶）將 Poly(A)加尾和反轉錄一步法高效完成 miRNA 對應的 cDNA 合成；miRNA 檢測使用 2 x miRNA qPCR Mix（含有通用型 ROX）。適用于 Total RNA 或者 small RNA 等包含 miRNA 的樣品。
操作步驟：
一、miRNA 3’末端進行Poly (A)加尾 和 逆轉錄反應（第一鏈合成）
1. 冰上，在 RNase-Free PCR 管中，加入以下組分：(先加其他組分，最后再加入 miRNA RT Enzyme Mix)
Components | Volume |
Total RNA* | 2 μg |
2 × miRT Reaction Mix | 10 μl |
miRNA RT Enzyme Mix | 2 μl |
RNase-Free H2O | Up to 20 μl |
注意事項：miRNA RT Enzyme Mix非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸頭外，導致損失，用前請點甩離心，并且避免吸頭外壁沾附損失。Enzyme Mix內酶都是過量的，即使每次按照 1.8μl使用，也不影響使用效果。
*在反應中使用的total RNA 必須包含有小分子RNA(miRNA)。此過程也可以使用富集的miRNA，單純miRNA無法直接用分光光度計定量，建議直接加入2μl ~5μl。可根據目的miRNA豐度決定加入量，但是對于低豐度miRNA 樣品而言(如血清血漿提取物)，可直接加入最大體積8 μl。
2. 輕柔吸打混勻，點甩離心，42℃孵育60 min，進行miRNA加尾和逆轉錄反應。
3. 85℃加熱5 sec，終止反應。合成的cDNA反應液可放置于-20°C保存；也可以直接進行下游qPCR檢測。
二、進行miRNA的熒光定量檢測。
Forward Primer設計原則：(上游引物需要自備）
1. 遵循引物設計的zui普遍原則。
2. 以成熟的miRNA序列為基礎，將U替換成T，這是最基礎和zui簡單的設計方法。
3. 試劑盒中提供的下游引物的Tm 值為65℃，設計上游引物的Tm值要盡量保證在65℃左右。
4. 若按照原則2 的方式直接設計的引物其Tm 值過低，可以在引物的5’端添加幾個堿基（最好為G 或C 堿基）；也可以在3’端添加1個或幾個A堿基；或者5’端和3’端同時修飾。
5. 若按照原則2 的方式直接設計的引物其Tm 值過高，可以在引物的5’或3’端去掉幾個堿基。
操作步驟：
1. 冰上配制qPCR反應體系：（以20μl反應體系為例）
Components | Volume (20μl) | Final Concentration |
2 x Universal SYBR Green qPCR Mix | 10 μl | 1× |
miRNA第一鏈cDNA | Variable | As required |
Forward Primer (10μM) | 0.4 μl | 0.2 μM each |
Reverse Primer (10μM) | 0.4 μl | 0.2 μM each |
RNase free H2O | Up to 20 μl | Not applicable |
1） 推薦模板加樣量為1-2μl，miRNA 第一鏈cDNA不應超過總反應體系的10%，對于特殊的檢測體系中，高含量的cDNA模板易導致非特異性擴增，根據所檢測miRNA的豐度適當的稀釋cDNA（10倍或者100倍）。
2） 通常推薦引物濃度為0.2 μM，就可以得到較好的結果，反應效果不佳時可在0.1 - 1.0 μM范圍內進行調整。擴增效率不高的情況下，可提高引物濃度；發生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優化反應體系。
2. qPCR反應程序
二步法特異性高，三步法擴增效率高。
如果融鏈曲線較差，可以嘗試兩步法擴增或提高退火溫度；如果因使用Tm值較低的引物等原因，得不到良好的實驗結果時，可嘗試加長延伸時間或者進行三步法PCR擴增。
miRNA反轉錄/熒光定量檢測試劑盒
